A cikk utoljára módosult: 14.08.2017.

Szövegdoboz: A Human CytomegalovírusPCR módszerrel történő kimutatása laboratóriumunkban

 

A Human Cytomegalovírus(HCMV) a Herpesvírusok  családjába tartozik (Herpesvirinae: α,β,γ ). A Herpes Vírusok elnevezése a görög herpes, herpetos  (kígyó, csúszómászó) szóból ered. A Herpes vírusoknak több mint 100 típusát izolálták hüllőkben, madarakban, kétéltűekben, rovarokban, halakban és emlősökben. A Herpesvírusok a gazdasejt sejtmagjában replikálódnak és a fertőzött sejtek lízisét okozzák. A vírusjellemző tulajdonsága a látenciára való hajlam. A fertőzést követően a vírus perzisztál a gazdaszervezetben, monocytákban, a PMNL sejtekben, a T limfocitákban a csontvelő progenitor sejtjeiben valamint egyéb sejttípusokban. A látens vírus genom vagy annak bizonyos génjei reaktiválódhatnak és teljes vagy részleges vírusszaporodás jöhet létre. A részleges reaktiváció esetén az igen korai (ImmediateEarly) IE gének fejeződnek ki elsősorban.

A Human Cytomegalovírus a Betaherpesvirinae alcsaládba tartozik. A Cytomegalovírus a legnagyobb méretű genommal rendelkezik a herpesvírusok között. A virion több mint 20 struktúrproteint tartalmaz. A HCMV nukleinsava a virionban duplaszálú lineáris DNS(a CMV virion a DNS mellett mRNS-t is tartalmaz), a fertőzött sejt magjában cirkuláris formába alakul át. Sejttenyészetben a HCMV szaporodási ciklusa lassú ~24 óra. Fertőzött sejtekben jellegzetes magzárványt(bagolyszem) és sejtmegnagyobbodást okoz.

 

A Humán Cytomegalovírus fertőzés tünetei és járványtana:

 

A HCMV fertőzés immunológiailag egészséges egyénekben legtöbbször tünetmentes. A fertőzés leggyakrabban kora gyermekkorban jön létre és az átvészeltség az életkorral nő. A felnőtt lakosság életkorától és szociális helyzetétől függően 50-90 %-ban szeropozitív világszerte. A magyarországi 40 éven felüli lakosok közel 50%-a, a 70 éven felüliek  90%-a szeropozitív.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                              A HCMV tünetei és szövődménye 

cmvmegjelenes

 Berencsi Gy. :  Orvosi molekuláris virológia

 

A fertőzés létrejöttéhez közeli kontaktus szükséges a fertőzött és a vírust ürítő egyénnel vagy annak nyálával, genitális váladékával, anyatejjel.A HCMV vírus receptora az MHC-1 fehérje, így az ember valamennyi sejtjében szaporodni képes, a placenta cytotrophoblastjainak fertőzését is ezek teszik lehetővé. Így képes a vírus átjutni a magzatba is.

 

Kongenitális fertőzések esetén az újszülöttek 1%-a születik HCMV fertőzéssel, ezek 10%-a maradandó károsodással jár együtt (főleg központi idegrendszeri érintettséggel). A magzat a placentán keresztül fertőződik amennyiben az édesanya a primer fertőzést a terhesség alatt kapja meg. A központi idegrendszer súlyos károsodása a transzplacentáris fertőzés következménye.

 

Szülés közben is történhet fertőződés, előfordul olyan eset, amikor az anya tünetmentesen üríti a vírust.

 

A transzplantáltak 90%-ánál kialakul a HCMV fertőzés. Az AIDS betegek közel 100%-a fertőzött. 

 

Humán Cytomegalovírus fertőzés korai, gyors diagnosztikájának kiemelt jelentősége van:

·         Az immunszupresszált, immundeficiens egyéneknél

·         Kongenitális fertőzések esetén

·         Újszülöttek vírusfertőzésekor

·         Anyatej donációnál

·         Differenciáldiagnosztikai szempontból

·         Transzplantált betegeknél

·         A HCMV fertőzés reaktivációja és perzisztáló fertőzés esetén

 

A Human Cytomegalovírus laboratóriumi diagnosztikája:

 

A HCMV direkt kimutatása történhet:

·         Vírusizolálás, szövettenyészeten: HEL, MRC-5 sejtkultúrán, jellegzetes CP hatást írtak le 14-28 nap után

·         In situ hibridizációs módszerrel

·         PCR technika alkalmazásával

 

A HCMV indirekt kimutatása történhet:

·         IgG, IgM antitestek kimutatásával szérumból ELISA, ELFA módszerrel (két módszer: ELISA +IF kombinációja). Kiegészítő szerológiai vizsgálatok azIgGaviditás és azIgA meghatározása.

Fals pozitív eredményt ad transzfúzió adását és immunglobulin terápiát (három hónapon belül)követően, fals negatív szerológia eredményt kaphatunk immunhiánnyal járó kórképeknél, valamint immunszupresszívkezelés esetén.

 

A laboratóriumban a Human CytomegalovírusReal-Time PCR(kvalitatív és kvantitatív) módszerrel történő kimutatását különböző mintatípusokból végezzük (vér, vizelet, beszárított vérminta,anyatej, gasztroenterológiai betegségben(IBD) szenvedőktől származó bioptátumokból(stb).

 

A HCMV-PCR módszerrel történő kimutatása:

 

A HCMV -PCR módszerrel történő kimutatása egy specifikus és konzervatív DNS szekvencia detektálása. A CE-IVD minősítéssel ellátott PCR kit a HCMV dsDNS kimutatására és kvantifikálására készült. A technika alapja a mikroorganizmus egy speciális targetszekvenciájának amplifikálása és detektálása a PCR reakció során fluoreszcens festékkel jelölt próbák segítségével. A Real time-PCR módszer alkalmazásával kvalitatív és a kvantitatív eredmény is megadható. A vírus genom jelenléte PCR vizsgálattal igazolható. A módszer rendkívül gyors és érzékeny és nem drágább szerológiai vizsgálatoknál.

 

 

Real-Time PCR módszer amplifikációs görbe

 

PCR módszer előnye: Már a tünetek megjelenése előtt (~8-10 nappal) kimutatható a virus a vérmintából a kópiaszám monitorozásával nyomon követhető a fertőzés lefolyása.  Szerológiai vizsgálattal a fertőzést követő ~2 hét után tudjuk az IgM  antitestet detektálni a szérumból. Az IgG jelenléte a már lezajlott fertőzésre utal, az IgGaviditás vizsgálattal azt lehet behatárolni, hogy a fertőzés 3 hónapnál régebben történt e vagy sem.

 

A PCR módszer alkalmazásának nagy előnye, hogy a HCMV kimutatása különböző mintatípusból elvégezhető. Gasztroenterológiai betegektől származó bioptátumok vizsgálata során elkülöníthető a szisztémás fertőzés illetve a vírus részleges reaktivációja. Gasztroenterológiai betegeknél (IBD) a megfelelő terápia megválasztásához különösen fontos annak eldöntése, hogy a gyulladásos bélbetegség hátterében jelen van-e és milyen kópiaszámban a HCMV.  A  PCR módszer alkalmazásával önmagában a primer fertőzés nem különíthető el. Primer fertőzés gyanúja esetén szükséges a HCMV szerológiai vizsgálata egy ún. szerológiai “alapstátusz” felvétele, még a terápia megkezdése előtt.A vírusfertőzés kinetikáját a kópiaszámmal monitorozhatjuk. Ezáltal megvalósulhat a célzott, költséghatékony, személyre szabott terápia.

 

Összefoglalás:

 

A laboratóriumban a Human Cytomegalovírusdirect (PCR módszer) és indirekt (szerológiai vizsgálat) kimutatása érzékeny, pontos és költséghatékony diagnosztikai módszerek alkalmazásával történik. A két egymástól független módszerrel átfogó diagnosztikai képet kapunk egyrészt a paciens szerológiai státuszáról, azaz átesett e már HCMV okozta fertőzésen és ha igen, ez 3 hónapnál régebben történt e vagy sem (CMV IgG, IgM szerológiai vizsgálata, kiegészítve aviditásvizsgálattal) illetve az esetleges fertőződést követő vérvétel időpontjától függően az éppen zajló HCMV infekcióról.  Real-Time PCR módszerrel különböző mintatípusokból a HCMV genetikai azonosításával és kópiaszámának megadásával hozzásegítjük a klinikusokat a helyes diagnózis felállításához és a megfelelő, költséghatékony  terápia megválasztásához.

 

Irodalomjegyzék:

 

1.      Berencsi György: Orvosi molekuláris virológia

Convention Budapest Kft. Budapest, 2005

2.      Evaluation of CytomegalovirusInfectionsTransmittedviaBreastMilkinPretermInfantswith a Real-Time PolymeraseChainReactionAssay

Pediatrics 2003, 111,1323

 

 

 

 

Szabóné Halász Erika őrnagy, részlegvezető mikrobiológus 

Magyar Honvédség Egészségügyi Központ

Honvédkórház

Központi Laboratóriumi Diagnosztikai Osztály

Molekuláris Genetikai Laboratóriumi Részleg